Proiect bilateral Romania-Franta 315/14.05.2009

Sinteza si caracterizarea de nanoparticule magnetice PEG-magnetita

CUPRINS

Obiectiv general
Obiectivele fazei II de executie
Rezumatul fazei II de executie
Descierea stiintifica si tehnica a fazei II de executie
Rezultate si discutii
Introducere
            Sinteza copolimerului polidimetilsiloxan grefat cu PEO si grupari carboxilice (PDMS-  
            PEO-COOH). Caracterizare structurala
Sinteza nanoparticulelor core-shell magnetita-PDMS-PEO-COOH, insolubile in apa.  
Caracterizare structurala, dimensionala si morfologica prin FTIR si AFM
Obtinere de suspensii coloidale stabile in apa pe baza de  magnetita-PDMS-PEO- COOH
Obtinere de suspensii coloidale stabile in apa pe baza de  magnetita –acid oleic
Studii reologice si electro-reologice ale suspensiilor apoase  de particule magnetice  in    
prezenta  de ADN si poliamidoetil fosfit
Concluzii
Publicatii
Buget
Anexe (Scheme de reactie, Figuri, Tabele, Bibliografie)

Obiectiv general: Sinteza si caracterizarea de nanoparticule magnetice PEG-
                          magnetita

Obiectivele fazei II de executie (2010)

1. Sinteza copolimerului polidimetilsiloxan grefat cu PEO si grupari carboxilice (PDMS-PEO-COOH). Caracterizare structurala.
2. Sinteza nanoparticulelor core-shell magnetita-PDMS-PEO-COOH, insolubile in apa. Caracterizare structurala, dimensionala si morfologica prin FTIR si AFM.
3. Obtinere de suspensii coloidale stabile in apa pe baza de  magnetita-PDMS-PEO-COOH.
4. Obtinere de suspensii coloidale stabile in apa pe baza de  magnetita –acid oleic.
5. Studii reologice si electro-reologice ale suspensiilor apoase  de particule magnetice  in prezenta  de ADN si poliamidoetil fosfit.

REZUMAT

Proiectul continua colaborarea de peste 10 ani cu colectivul din Franta. Impreuna cu acest colectiv s-au publicat peste 10 articole in reviste cotate ISI (ex. Macromolecules, Polymer, High Performance Polymers, etc) si au fost efectuate peste 10 stagii de cercetare de membrii ai colectivului roman in laboratorul francez si peste 5 stagii de catre colectivul francez in laboratorul din Romania.
In cadrul prezentului proiect principalul obiectiv a fost de a sintetiza si a analiza proprietatile unor particule magnetice acoperite  pentru aplicatii biomedicale. In particular, au fost preparate nano-particule magnetice cu dimensiuni controlate de tip magnetita/siloxan-polietilenglicol si magnetita/acid oleic  hidrofobe (se obtin suspensii stabile in solventi hidrofobi) si nano-particule magnetita/siloxan polietilenglicol si magnetita/acid oleic hidrofile (se obtin suspensii stabile in apa).
Particulele acoperite au fost caracterizate prin spectroscopie FT-IR, miscroscopie de forta atomica (AFM), de baleiaj (SEM) si de de transmie (TEM), prin analize dimensionale (Coulter® Nano-sizer). De asemenea, au fost determinate proprietatile magnetice si reologice ale acestora.
Ultima parte a studiului, care este in progres, s-a axat pe studiile reologice si electro-reologice ale suspensiilor stabile in apa de particule magnetice in prezenta de ADN si poliamodoetil fosfit pentru a determina interactiunea particula magnetica acoperita cu PEO si grupari carboxilice cu ADN pentru stalilirea mecanismului de obtinere a bioconjugatelor. In acest studiu s-a considerat ca model conjugatul magnetita-acid oleic cunoscut in literatura.
Particulele magnetice hidrofile prezinta interes in aplicatiile biomedicale, cum ar fi imagistica RMN, iar cand sunt purtatoare de principiu activ in tratarea unor tumori canceroase.

            In aceasta etapa, care este o continuare a etapei din 2009 au fost preparate suspensii coloidale magnetice in urmatoarele etape:

Publicatii:

 Buget:

Rezultate si discutii
Introducere
Autoasamblarea copolimerilor amfifili, care contin in structura lor secvente hidrofobe sau hidrofile, prezinta un interes crescut datorita posibilitatii controlului proprietatilor solutiei lor si investigarii in detaliu a fortelor, care determina agregarea2-7. Astfel de compusi macromoleculari pot fi utilizati in calitate de compusi model pentru determinarea unui anumit comportament specific al sistemelor biologice complexe. Astfel este descrisa in literatura posibilitatea utilizarii copolimerilor amfifili in procesul de acoperire al unor anumite particule si ca sisteme transportoare de medicamente. Copolimerii amfifili introdusi intr-un solvent selectiv pentru una sau doua secvente, se autoasambleaza in agregate de micele, care contin un miez constituit dintr-o secventa insolubila inconjurat de o secventa solubila stil coroana2. Intr-un amestec de solventi polari/nepolari secventele hidrofile sau hidrofobe ale copolimerilor amfifili se directioneaza catre solventul polar, respectiv nepolar. Acest comportament tipic specific este deosebit de interesant, deoarece separarea de faza este importanta in design-ul nano-obiectelor si nanoparticulelelor de diferite forme8. Recent s-a studiat sinteza reactoarelor moleculare active pe baza de poliorganosiloxani amfifili utilizati in obtinerea de coloizi pe baza de Zn2+ si de aur9-11. Incompatibilitatea pronuntata datorita hidrofobicitatii polidimetilsiloxanului (PDMS) cu marea majoritate a polimerilor organici este balansata de prezenta unitatilor solubile de PEO, copolimerii dibloc PDMS-poli(etilen oxid) (PEO) sunt puternic amfifili si se autoasambleaza in solutie cu formarea unor morfologii diferite in functie de natura solventului, gradul de polimerizare si de proportia intre secventele hidrofobe si hidrofile2.
Aceste materiale prezinta aplicatii tehnologice importante; copolimerii dibloc amfifili care contin grupe carboxilice se utilizeaza la obtinerea de nanofluide magnetice stabilizate steric12. Acesti copolimeri bloc PDMS-PEO actioneaza ca surfactanti de stabilizare pentru particulele de magnetita datorita capacitatii gruparilor carboxilice de a interactiona prin legaturi de hidrogen cu gruparile hidroxilice de pe suprafata particulelor de magnetita12,13.
Pana in prezent, in literatura de specialitate a fost descrisa sinteza, caracterizarea copolimerului amfifil grefat siloxan/α-carboxiester-poli(etillen oxid) si micelizarea atat in solutie apoasa cat si in solutie de toluen1,14. S-a studiat de asemenea formarea microparticulelor de magnetita de tip „core-shell” stabilizate cu copolimerul grefat siloxan/α-carboxiester-poli(etillen oxid)15,16.

Sinteza  polidimetilsiloxaului grefat cu PEO w- functionalizat cu grupari carboxilice

Copolimerul poli{dimetilsiloxan-g-[carboxiester-poli(etilen oxid)]} (PDMSgPEO-COOH) a fost obtinut in mai multe etape conform schemei 1. Caracteristicile prepolimerilor si a copolimerilor finali sunt ilustrate in tabelul 1.
Structura copolimerului PDMSgPEO-COOH a fost pusa in evidenta prin 1H-RMN (Figura 1), iar randamentul mic de reactie (65%) este datorat reactiilor secundare posibile (descompunerea gruparilor COOH si reticularea) precum si procedurii laborioase de purificare a produsului. Rezultate similare au fost observate si pentru alti copolimeri amfifili pe baza de PEO, care pot fi explicate prin posibila absorbtie a segmentelor de PEO in materialul coloanelor analitice17.
Utilizarea copolimerilor bloc amfifili in sinteza de nanoparticule ofera avantajul proprietatilor de autoasamblare. Dupa cum sugereaza si numele, copolimerii bloc amfifili contin atat segmente hidrofobe cat si hidrofile. Acest caracter dualist le confera aplicatii practice interesante. De exemplu, autoasamblarea polimerilor este in mare masura demonstrata in sisteme biologice, in cazul plierii proteinelor in elice sau foaie de ziar si agregate pentru structuri asemanatoare ribozomilor18.

Suspensii coloidale stabile in apa pe baza de magnetita- PDMSgPEO-COOH (schema 2) au fost obtinute in doua etape:

Particulele de magnetita acoperite au fost obtinute prin coprecipitarea solutiilor apoase de FeCl3 x 6H2O si FeCl2 x 4H2O. Aceste solutii au fost agitate mecanic continuu sub atmosfera de azot, dupa care s-a adaugat apoi o solutie de hidroxid de amoniu (25%) pana la pH 9–10. S-a format un precipitat de culoare neagra de particule magnetice. In etapa urmatoare, peste dispersia apoasa de magnetita s-a adaugat o solutie de PDMSg-PEO-COOH  in diclormetan. Dupa o ora s-a adaugat solutie apoasa de HCl in picatura pana la pH acid (pH ~ 3).
Particulele hidrofobe de Ma/PDMSg-PEO-COOH au fost separate din emulsie prin evaporarea diclormetanului la rotaevaporator sub vid, apoi au fost suspendate in toluen pentru indepartarea siloxanului nereactionat. Particulele de culoare neagra de Ma/PDMSg-PEO-COOH au fost filtrate, spalate cu apa si acetona si uscate apoi la 60oC.

Caracterizare structurala
Particulele hidrofobe Ma/PDMSg-PEO-COOH au fost caracterizate prin spectroscopie FTIR (Figura 2), miscroscopie de forta atomica (Figura 3), SEM-EDX. (Figura 4) si s-au determinat proprietatile magnetice (Figura 5). Particulele sunt de forma sferica, prezinta o distributie uniforma a metalului, au dimensiuni cuprinse intre 50-60 nm si prezinta proprietati magnetice in concordanta cu cele din literatura1,19.

Obtinerea suspensiilor stabile in apa pe baza departicule de magnetita- PDMSgPEO-COOH.
La particulele magnetice Ma-PDMSgPEO-COOH s-au adaugat un al doilea strat de PDMSgPEO-COOH in amestec de solventi apa/toluen prin intermediul interactiunile hidrofobe intre lanturile polidimetilsiloxanice, lanturile hidrofile PEO-COOH de la al doilea strat sunt dispuse in exteriorul particulelor.

Obtinerea suspensiilor stabile in apa pe baza particule magnetita-acid oleic
Sinteza s-a realizat in doua etape:

Studii reologice si electro-reologice  ale particulelor solubile in apa in prezenta de ADN si poliamidofosfit.
S-au realizat studii reologice si reo-electrice ale suspensiilor coloidale stabile in apa (magnetita- PDMSgPEO-COOH si magnetita-acid oleic) in diferite concentratii in prezenta de ADN si poliamidofosfit. Studiile arata ca particulele acoperite se conjuga cu polimerii mentionati, obtinandu-se suspensii de conjugate particula magnetica-ADN sau particula magnetica – poliamidofosfit. Mecanismul de complexare va fi pus la punct pana la sfarsitul anului 2010 impreuna cu partenerul francez.

Concluzii
- Sinteza si comportamentul copolimerului amfifil polidimetilsiloxan grefat cu poli(etilen oxid) cu grupari terminale carboxilice (PDMSgPEO-COOH) in apa.
Copolimerul a fost sintetizat printr-o metoda de sinteza, care cuprinde mai multe etape intermediare. Masuratorile de tensiune superficiala si de fluorescenta arata ca are loc micelizarea copolimerului grefat atat in mediu apos cat si in mediu organic. In forma neionizata, in solutii apoase la pH=4 copolimerul prezinta trei etape de agregare si anume, micelizare cu un singur lant la concentratii de pana la CMC1=1,01 g/L, micelizare intre lanturile polimerice in intervalul dintre cele doua concentratii CMC1 si CMC2=1,73 g/L urmata de agregarea intre micele alaturi de formarea unui gel la concentrati mai mari. Dimensiunile micelelor creste cu cresterea concentratiei solutiei de la 18 la 46 nm, valori care corespund agregarii intr-un singur lant sau in mai multe lanturi.
In forma ionizata, in solutii apoase de copolimer (pH=8) din studiile de fluorescenta se obtine doar o valoare de CMC=5,25 g/L marcand tranzitia dintre micelizarea intr-un singur lant cu miez siloxanic si invelis extins de PEO-COOH si asocierilor intre lanturile polimerice formate in ciuda prezentei gruparilor carboxilice disociate. Ambele agregate micelare au forme de bagheta/fir (conuri scurte).    
Formarea agregatelor in urma interactiunilor gruparilor –COOH cu lantul PEO in solutia de toluen a copolimerului hidrofob-hidrofil PDMSgPEO-COOH a fost demonstrata prin fluorescenta si difractometrie. Spectrele de emisie a pirenului in solutia de toluen a copolimerului prezinta o emisie apreciabla a excimerului probei in toluen cu cresterea concentratiei copolimerului, indicand existenta regiunilor de densitate ridicata in polimer.
Formarea particulelor magnetice acoperite cu copolimerul PDMSgPEO-COOH a fost demonstrata prin FT-IR. Imaginile AFM ale particulelor de magnetita acoperite cu PDMSgPEO-COOH prezinta o morfologie de tip „core-shell” cu o forma aproximativ sferica a particulelor si un diametru mediu de 60 nm. Din analizele EDX se poate observa distributia uniforma a elementelor din compozitia particulelor Ma-PDMSgPEO-COOH.
Studiile reologice preliminarii demonstreaza formarea bioconjugatelor particula magnetica acoperita-biopolimer.
PUBLICATII: S-au publicat 2 articole in reviste cotate ISI, un articol este in curs de redactare si 2 participari la simpozioane internationale.
Buget: 9 zile (2 stagii scurte) pentru 2 cercetatori francezi in laboratorul roman
20 zile pentru 1 cercetator roman in laboratorul francez.

Schema 1. Sinteza copolimerului poli{dimetilsiloxan-g-[carboxiester-poli(etilen oxid)]} (PDMSgPEG-COOH).

Fig. 2. Spectrul 1H-RMN al copolimerului PDMSg-PEG-COOH

Schema 2. Procesul de invelire a particulelor de magnetita cu un ssingur strat de  PDMSg-PEG-COOH
si cu dublu strat de PDMSgPEG-COOH

Tabel 1. Caracteristicile precursorilor si copolimerului pe baza de polidimetilsiloxan

a calculat din integralele caracteristice protonilor din spectrul 1H-RMN; b din GPC;
c1 calculat din procentul de H si din Mn ale H-PDMS;
c2 100x = 5890. 0.0529 + .1150x, unde x este numarul de mol Si-H/mol H-PDMS;
c3 100x = 15040.0.048 + 100.04x, unde x este numarul de mol Si-PEO-OH/PDMSgPEO-OH mol;
d calculat; e calculat folosind Mn al H-PDMS;
f determinat dupa Nicholas20;
g calculat folosind continutul de grupari HO, Mn a precursorilor H-PDMS si A-PEO-TS;
h calculat folosind continutul de grupari HO, Mn a precursorilor H-PDMS si A-PEO-TS;
i calculat folosind Mn experimental pentru copolimerul PDMSgPEO-OH;
j determinat prin titrare potentiometrica;
k calculat folosind Mn experimental pentru copolimerul PDMSgPEO-OH si calculata din continutul in grupari COOH;
l calculat folosind Mn experimental pentru copolimerul PDMSgPEO-OH si din continutul in grupari COOH experimental.

Bibliografie
1. L.Pricop, A.Durdureanu-Angheluta, M.Pinteala, M.Spulber, A.Fifere, N.L.Marangoci, A.I.Dascalu, R.Tigoianu, V.Harabagiu, B.C.Simionescu « Synthesis and micellization of polydimethylsiloxane – carboxy-terminated poly(ethylene oxide) graft copolymer in aqueous and organic media »,  e-Polymers  no. 093 (2010).
2. Riess, G. Progr. Polym. Sci. 2003, 28, 1107.
3. Astafieva, I.; Khougaz, K.; Eisenberg, A. Macromolecules 1995, 28, 7127.
4. Lysenko, E.A.; Bronich, T.K.; Slonkina, E.V.; Eisenberg, A.; Kabanov, V.A.; Kabanov, A.V. Macromolecules 2002, 35, 6351.
5. Schadler, V.; Kniese, V.; Thurn-Albrecht, T.; Wiesner, U.; Spiess, H.W. Macromolecules 1998, 31, 4828.
6. Jain, S.; Bates, F.S. Science 2003, 300, 460.
7. Discher, D.E.; Eisenberg, A. Science 2002, 297, 964.
8. Shandryuk, G.A.; Matukhina, E.V.; Vasil’ev, R.B.; Rebrov, A.; Bondarenko, G.N.; Merekalov, A.S.; Gas’kov, A.M.; Talroze, R.V. Macromolecules 2008, 41, 2178.
9. Voronov, A.; Kohut, A.; Peukert, W. Langmuir 2007, 23, 360. 
10. Jungmann, N.; Schmidt, M.; Maskos, M. Macromolecules 2003, 36, 3974
11. Racles, C.; Cazacu, M.; Ioanid, A.; Vlad, A. Macromol. Rapid Commun. 2008, 29, 1527.
12. Moeser, G.D.; Green, W.H.; Laibinis, P.E.; Linse, P,.;Hatton, T.A. Langmuir 2004, 20, 5223.
13. Wilson, K.S.; Harris, L.A.; Goff, J.D.; Riffle, J.S.; Dailey, J.P. European Cell and Materials 2002, 3, 206.
14. Anamaria Durdureanu-Angheluta, Lucia Pricop, Mariana Pinteala, Radu Tigoianu, Iuliana Stoica, Andrei Dascalu, Valeria Harabagiu, Bogdan C. Simionescu, Micellization in amphiphilic siloxane/α-carboxyester-poly(ethylene oxide) graft copolymers solutions. Applications, Frontiers in Macromolecular and Supramolecular Science Second Cristofor I. Simionescu Symposium, Iasi, Romania, 02-03.06.2009
15. A.Durdureanu-Angheluta, M. Pinteala, L. Pricop, I. Stoica, V. Harabagiu, B.C. Simionescu, “Magnetite particles functionalized with an COOH-siloxane”, ESF-UB Conference in Biomedicine Nanomedicine 2008, San Feliu de Guixols, Spania, 19-24 septembrie 2008.
16. A. Durdureanu-Angheluta,  L. Pricop, M. Pinteala, V. Harabagiu, B. C. Simionescu, PARTICULE MAGNETIQUES “CORE-SHELL“ OBTENU PAR POLYSILOXANES GREFFE AVEC CARBOXYLIQUES GROUPS, IXème Colloque Franco - Roumain sur les Polymères SYNTHESE ET PROPRIETES DES POLYMERES; LES POLYMERES ET L’ENVIRONNEMENT, Alba Iulia, Roumanie 27 – 29 Août 2009.
17. (a) Creutz, S.; Teyssie, P.; Jerome, R. Macromolecules 1997, 30, 6; (b) Bines, F.L.; Billingham, N.C.; Armes, S.P. Macromolecules 1996, 29, 3416.
18. Whitesides, G. M.; Mathias, J. P.; Seto, C. T., Science, 1991, 254, 1312
19. A. Durdureanu-Angheluta, L.Pricop, I.Stoica, C.-A. Peptu, A.I.Dascalu, N. Marangoci, M.Spulber, M.Pinteala, B.C. Simionescu, « Silicon magnetic fluids based on magnetite particles covered with α-trietoxysilil- polydimethylsiloxane », Journal of Magnetism and Magnetic Materials 322, 2956–2968 (2010)  
20. Nicholas, D.; Cherons, T. Organic Functional Group Analysis by Micro and Semimicro Methods, Ed. John Willes & Sons, INC, New York, London, Sidney, 1964, pp.493-494.